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Nature热评:CRISPR正推动CAR-T细胞快速前进

发布时间:2021-03-09

随着人们对免疫治疗兴趣的增长,对更好的CAR-T细胞制造工具的需求也在增长。CRISPR技术的进步能解决这个问题吗?


在过去的十年里,一种新的免疫治疗工具进入了临床。被设计成表达嵌合抗原受体的T细胞,即CAR-T细胞,已经被证明可以帮助血癌患者。2011年的一项关键研究使用第二代CAR-T细胞来实现大多数测试患者T细胞的持续激活和缓解。


一年后出现了另一个重大突破,两个小组描述了一种名为CRISPR-Cas9的新型基因编辑工具,并演示了它在真核细胞中的应用。这两份报告帮助开启了基因编辑的新时代。


尽管基因编辑有可能改善细胞工程,但CAR-T细胞和CRISPR的交叉还需要几年时间。



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寻找方法


从一开始,CAR - T细胞就显示出了巨大的杀癌潜力,但制造这些细胞既繁琐又复杂。

最初,T细胞工程依赖于慢病毒或逆转录病毒将DNA片段导入细胞进行同源重组。病毒允许DNA片段的稳定整合和长期表达。然而,获得这些所需的临床级试剂非常昂贵,而且这些载体只能携带有限数量的DNA,而这些DNA有可能随机整合到基因组中。

为了推进CAR-T细胞治疗,研究人员需要找到一种更有效的方法来设计长CAR序列。



CRISPR驱动CAR的发展

从一开始,CRISPR就像是制造T细胞的理想方法。这是一个简单的过程,具有最小的脱靶效应,适用于多种细胞类型。但CRISPR在一个领域遇到了困难。

CRISPR-Cas9通过产生靶向双链DNA (dsDNA)断裂,然后通过细胞的非同源末端连接途径修复,从而有效地产生小的突变。然而,当使用同源导向的修复机制插入外源DNA时,CRISPR编辑的效率可能低得可怜。然而,插入DNA对于制造CAR-T细胞至关重要。

位于奥马哈的内布拉斯加大学医学中心(University of Nebraska Medical Center)的基因工程师Channabasavaiah Gurumurthy表示:"Easi-CRISPR是一种更好的工具,适用于同源性导向修复。"

Gurumurthy和他的合作者发现,当使用CRISPR将DNA插入细胞时,长单链DNA (ssDNA)是比双链DNA更有效的模板。使用Easi-CRISPR,长ssDNA与含有Cas9和导向RNA的预组装复合物一起被注入,导致更高的靶标编辑率和更低的脱靶编辑率。之前的报道显示,化学合成的具有2-甲氧基和硫代磷酸基团修饰的单导向RNA (sgRNA)增强了原代细胞的细胞内稳定性和编辑效率。此后,CRISPR-Cas9似乎开始成为T细胞内产生缺失和插入的有效工具。

去年,Alexander Marson、Gurumurthy和他的同事们利用Easi-CRISPR对人类T细胞的结构和功能进行了重新编程,且不需要病毒载体。本研究表明,将ssDNA作为同源性导向的修复模板对T细胞进行CRISPR编辑,与dsDNA模板相比,能够更准确、更有效地进行大规模的基因插入,并且脱靶整合概率更低。



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展望未来


虽然有希望,但还有一个重要的考虑。"长ssDNA序列很难在实验室中产生,尤其是在基因编辑实验中需要高浓度的长ssDNA," Marson实验室的成员、该研究的第一作者Theodore Roth说。

一些公司和研究开发人员正试图解决这个问题,他们正在研究有效生成大量长ssDNA的方法。总部位于新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway)的全球生物技术公司GenScript以其领先的DNA合成技术而闻名。该公司最近开始提供数千个核苷酸长度的ssDNA,数量可达100微克--这是使用CRISPR进行T细胞重编程的理想选择。GenScript也是为数不多的提供完整的CRISPR解决方案的公司之一,包括HPLC纯化的、化学合成的sgRNAs,并通过末端修饰来增强CRISPR编辑。

基因编辑正在改变研究人员研究细胞工程的方式。像Easi-CRISPR这样的方法,连同DNA和RNA合成的改进,将进一步加强CAR-T细胞工程的努力,最终改善癌症治疗和人类健康。(生物谷Bioon.com)

参考资料:
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